什么是引物？

引物（primer），是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn)，在核酸合成反應(yīng)時，作為每個多核苷酸鏈進(jìn)行延伸的出發(fā)點(diǎn)而起作用的多核苷酸鏈，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯鏈形式進(jìn)行合成，因此引物的3′-OH，必須是游離的。

如何溶解引物？

干燥后的引物質(zhì)地非常疏松，開蓋前最好瞬時離心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，將引物粉末收集到管底。根據(jù)計算出的體積加入去離子無菌水或TE(pH8.0)緩沖液，室溫放置幾分鐘，振蕩助溶，離心將溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水，因為有些蒸餾水的pH值比較低（pH4-5）,引物在這種條件下不穩(wěn)定。

如何保存引物？

引物合成后，經(jīng)過一系列處理和純化步驟，旋轉(zhuǎn)干燥而成無色或白色絮狀干粉。

干 粉：運(yùn)輸時常溫運(yùn)輸，-20℃可以保存一年。

儲存液：配好后分裝成幾管，避免反復(fù)凍融，-20℃可以保存半年。

工作液：常規(guī)使用，4℃保存，也可-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

修飾熒光引物：需要避光保存，盡快使用為宜。

引物設(shè)計的基本原則：

1、引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。

2、引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。

3、引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。

4、兩個引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊。

5、引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有*互補(bǔ)序列。